Toxicidade de filtrados de cultura de Alternaria euphorbiicola em folhas de Euphorbia heterophylla - Plantas Daninhas (2024)

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Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20131Toxicidade de filtrados de cultura de Alternaria euphorbiicola ...1 Recebido para publicação em 2.3.12 e aprovado em 20.8.12.2 Pesquisador, D.Sc., Dep. de Química, Universidade Federal de Viçosa – DEQ/UFV, <eduardo@varejao.org>; 3 Professor, D.Sc.,DEQ/UFV; 4 Professor, Ph.D., DEQ/UFV; 5 Professor, Ph.D., Dep. de Fitopatologia – DFP/UFV; 6 Professor, D.Sc., Instituto deCiências Agrárias, Universidade Federal de Uberlândia – UFU.TOXICIDADE DE FILTRADOS DE CULTURA DE Alternaria euphorbiicolaEM FOLHAS DE Euphorbia heterophylla1Phytotoxicity of Alternaria euphorbiicola Culture Filtrates in Euphorbia heterophylla LeavesVAREJÃO, E.V.V.2, DEMUNER, A.J.3, BARBOSA, L.C.A.4, BARRETO, R.W.5 e VIEIRA, B.S.6RESUMO - A espécie fúngica Alternaria euphorbiicola é agente causal de severas necroses deinflorescência, queimas de folhas e cancros da haste em Euphorbia heterophylla (leiteiro ouamendoim-bravo), importante planta daninha responsável por grandes prejuízos à agriculturabrasileira. A aplicação de suspensões de esporos do fungo sobre populações da plantahospedeira resulta em rápida produção de necrose dos tecidos das plantas (24 a 48 horasapós aplicação). Essas observações levaram à conjectura de que o fungo possa produzirfitotoxinas in vitro capazes de causar lesão às plantas. O objetivo deste trabalho foi investigarpreliminarmente a produção in vitro de fitotoxinas por A. euphorbiicola sob diferentes condiçõesde cultivo. Os resultados mostraram que a composição do meio de cultura e as condições decultivo influenciaram a fitotoxicidade de filtrados de cultura, tendo o cultivo sob agitação ena ausência de luz favorecido a produção de metabólitos fitotóxicos pelo fungo. O filtrado dacultura em meio de Jenkins-Prior modificado, crescida sob agitação, no escuro e a 28 oC,apresentou a maior atividade fitotóxica, tendo produzido extensas necroses foliares e desfolhaem plantas de E. heterophylla. Esse filtrado de cultura foi submetido a extração seguida porfracionamento guiado por bioensaios. Uma fração cromatográfica constituída majoritariamentepor ácidos graxos de cadeia longa produziu halos cloróticos e necrose de folhas, assim comoobservado após a inoculação de E. heterophylla com o fungo. Esses resultados sugerem aparticipação de ácidos graxos no processo infeccioso na associação A. euphorbiicola xE. heterophylla.Palavras-chave: Ascomycota, fungo, amendoim-bravo, Euphorbia heterophylla, fitotoxinas, isolamento guiado porbioensaio.ABSTRACT - The fungal species Alternaria euphorbiicola was identified as causal agent ofinflorescence necrosis, leaf blight, and stem cancer in Euphorbia heterophylla (wild poinsettia), amajor weed responsible for great agricultural losses in Brazil. The application of spore suspensions ofthe fungus on specimens of the host plant resulted in production of disseminated necrosis at shorttime intervals (24 to 48 hours) after application. These observations led to the hypothesis that thefungus could produce phytotoxins capable of causing damage to the plant. The objective of thisstudy was to investigate the in vitro production of phytotoxins by A. euphorbiicola under differentgrowth conditions. The results showed that the culture medium and growth conditions influencedthe phytotoxicity of the culture filtrates. Growing the fungus under agitation in the dark resulted inhigher production of phytotoxic metabolites. The filtrate from the culture formed in modified Jenkins-Prior medium, under agitation, at 28 oC in the dark showed the highest phytotoxic activity. Thisfiltrate produced foliar necrosis and defoliation in E. heterophylla and was subjected to extractionfollowed by bioassay-guided fractionation. A chromatographic fraction consisting mainly of long-chain fatty acids produced bleached lesions and necrosis of the leaves, the same symptoms observedafter inoculation of the fungus in the host plant. These results suggest the involvement of thesephytotoxic fatty acids in the process of tissue invasion of E. heterophylla by A. euphorbiicola.Keywords: Ascomycota, fungus, wild poinsettia, Euphorbia heterophylla, phytotoxins, bioassay-guided fractionation.VAREJÃO, E.V.V. et al.Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20132INTRODUÇÃOO leiteiro ou amendoim-bravo, Euphorbiaheterophylla, é uma planta daninha altamentecompetitiva, considerada uma das principaisinvasoras nas culturas da soja e do feijão(Rizzardi et al., 2004; Carvalho et al., 2010;Cury et al., 2011).O controle de infestações de E. heterophyllavem sendo exercido principalmente com o usode herbicidas inibidores da enzima acetolac-tato sintase (ALS). Entretanto, o uso repetitivodesses herbicidas levou à seleção de popu-lações resistentes (Gazziero et al., 1998), como,por exemplo, a ocorrência de biótipos resisten-tes ao glifosato (Vidal et al., 2007; Cerdeiraet al., 2011) e o surgimento de biótipos commúltipla resistência a herbicidas inibidoresda ALS e inibidores da protoporfirinogêniooxidase (PROTOX) (Trezzi et al., 2005). Diantedesse quadro, torna-se de grande interesse abusca por novos compostos químicos para omanejo de E. heterophylla.Durante trabalhos de levantamento defungos fitopatogênicos associados a plantasdaninhas relevantes no Brasil, a espécieAlternaria euphorbiicola foi isolada a partir detecidos severamente infectados de Euphorbiaheterophylla (Barreto & Evans, 1998). Duranteestudos sobre o potencial de A. euphorbiicolacomo agente para o controle biológico deE. heterophylla, foi observado que a aplicaçãode suspensões de esporos do fungo sobrepopulações da planta hospedeira resulta emrápida produção de necrose de tecidos (24 a48 horas após aplicação). Esse período seriainsuficiente para os processos de germinaçãode esporos, penetração de tecidos, colonizaçãoe desenvolvimento de sintomas resultantesda infecção. Essas observações levaram àconjectura de que o fungo produz, antes mesmoda colonização da planta, fitotoxinas capazesde provocar necroses em E. heterophylla.A produção de metabólitos fitotóxicos porfungos fitopatogênicos e a capacidade dessescompostos de causar lesões em tecidos daplanta hospedeira encontram-se amplamentedescritas na literatura (Demuner et al., 2006;Strange, 2007; Möbius & Hertweck, 2009).Fatores como a diversidade estrutural e a ca-pacidade de produzir efeitos fitotóxicos empequenas concentrações e de atuar por novosmecanismos de ação fazem com que fitotoxinasfúngicas sejam consideradas uma fonte pro-missora para a produção de novos herbicidasnaturais (Hoagland, 2001; Duke et al., 2002).Ainda que não apresentem propriedadesadequadas para o uso direto, esses compostosmostram grande potencial como modelos paraa síntese de novos herbicidas (Barbosa et al.,2003; Chaves et al., 2006; Barbosa et al.,2009).A investigação da produção de fitotoxinaspor fungos fitopatogênicos normalmente ini-cia-se com a avaliação da fitotoxicidade defiltrados de cultura livres de células. Após operíodo de incubação, o meio de cultura é sub-metido à filtração, sendo o filtrado avaliado emensaios para demonstração de fitotoxicidade(Chen & Swart, 2002; Souza Filho & Duarte,2007). Estudos sobre a possível influência dascondições de crescimento sobre a fitotoxici-dade de filtrados de cultura podem ser condu-zidos, de modo que as condições mais favo-ráveis para a produção de fitotoxinas sejamutilizadas para fins de produção, extração,fracionamento e caracterização de compostosquímicos fitotóxicos (Berestetskyi, 2008).A agressividade e rapidez no desenvol-vimento de sintomas por A. euphorbiicola con-tra E. heterophylla despertaram o interessepelo isolamento, identificação e avaliação decompostos fitotóxicos produzidos pelo fungocomo candidatos a agentes naturais paracontrole químico de E. heterophylla. Nestetrabalho foi investigada a fitotoxicidade de fil-trados de cultura de A. euphorbiicola produzidossob diferentes condições de cultivo.MATERIAL E MÉTODOSProcedimentos gerais: extrações e proce-dimentos cromatográficos foram realizadosutilizando-se solventes de grau analítico. Asseparações cromatográficas em coluna foramfeitas usando-se sílica-gel 60 (70-230 mesh).Para cromatografia em camada delgadaanalítica, foram utilizadas placas de sílica-gel60 F254 com 0,25 mm de espessura e revelaçãocom luz ultravioleta (254 e 366 nm), seguidapor nebulização com solução alcoólica de ácidofosfomolíbdico. Os espectros na região do infra-vermelho (IV) foram obtidos em espectrômetroVarian FT-IR 660-IR, equipado com acessórioPlanta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20133Toxicidade de filtrados de cultura de Alternaria euphorbiicola ...Pike GladiATR. As análises por cromatografiaa gás acoplada a espectrometria de massasforam realizadas em equipamento ShimadzuGCMS-QP5050A, nas seguintes condiçõesoperacionais: método por impacto de elétrons(70 eV); modo scan, m/z 30,00 a 700,00; colunacapilar RTx5 (30 m x 0,25 mm, 0,25 μm); fluxodo gás de arraste (He) de 1 mL min 1; razão desplit 1:5; programação de temperatura: T1=40 oC por 5 min, gradiente de 4 oC min-1 atéT2= 80 oC e gradiente de 10 oC min-1 até T3=285 oC; temperatura do injetor de 290 oC; etemperatura do detector de 290 oC. Os consti-tuintes químicos foram identificados por com-paração dos espectros de massas com aquelesexistentes no banco de dados do equipamentoe pelo índice de kovat’s (Linstrom & Mallard,2005).Cultivo do fungo: Alternaria euphorbiicola(isolado KLN 06), originalmente isolado detecidos infectados de E. heterophylla, foi cul-tivado em placas de Petri contendo meio decultura Caldo de Vegetais-Ágar (Pereira et al.,2003) a 25 oC por sete dias. Discos de micélio(∅=10 mm) provenientes da periferia de cultu-ras em crescimento ativo foram asseptica-mente repicados para frascos erlenmeyers de2 L, contendo, cada um, 300 mL de diferentesmeios de cultura líquidos: Caldo de Vegetais(Pereira et al., 2003); meio de Jenkins-Priormodificado (Fargues et al., 2001); Czapek-Dox;e meio de Fries (Beadle & Tatum, 1941). Parainvestigação da possível interferência dascondições de cultivo na produção de compostosfitotóxicos pelo fungo, foram utilizadas asseguintes condições: A, cultivo sob agitação a150 rpm, no escuro, a 28 oC; B, cultivo está-tico, no escuro, a 28 oC; e C, cultivo estático,fotoperíodo de 12 h, a 28 oC. Os períodos deincubação para as culturas formadas sobagitação e sob cultivo estático foram de 14 e21 dias, respectivamente.Obtenção de extratos e frações cromato-gráficas: levando em consideração os resul-tados obtidos no estudo sobre o efeito decondições de cultivo na produção de fitotoxi-nas, adotou-se o cultivo do fungo em meio deJenkins-Prior modificado (Fargues et al., 2001)sob as condições de cultivo A, reconhecidascomo apropriadas para a produção de fitoto-xinas. Após o período de incubação, as culturasforam filtradas em membrana de náilon epapel-filtro Whatman no 1, para remoção demicélio e esporos. O filtrado da cultura foi liofi-lizado, fornecendo material sólido (67,68 g),que foi posteriormente ressuspenso em águadestilada para um volume final de 1 L. O pHda suspensão foi ajustado para 4,5 por adiçãode HCl 2 mol L-1, e a suspensão, extraída comacetato de etila (3 x 1 L). O extrato em acetatode etila foi submetido à secagem sobre MgSO4,filtrado e concentrado em evaporador rotatórioa 40 oC. O extrato bruto assim obtido (2,307 g)foi fracionado por cromatografia em colunade sílica-gel 60 com eluição por gradiente, uti-lizando hexano-acetato de etila 9:1 (v/v) a 0:1(v/v). Frações de cerca de 7 mL foram coleta-das em tubos de ensaio e agrupadas de acordocom o perfil em cromatografia em camadadelgada. A fração 2 (31 mg), eluída com hexano:acetato de etila 9:1 (v/v), foi submetida aanálises por IV e CG-EM.Ensaios biológicosForam realizados diferentes ensaiosbiológicos com plântulas e sem*ntes deE. heterophylla. Para investigação preliminarda produção in vitro de fitotoxinas pelos fungos,os filtrados de cultura foram submetidos a en-saios em câmara úmida (Pedras & Ahiahonu,2004) e testes de inibição de germinação ecrescimento radicular (Macias et al., 2000).Quanto ao fracionamento guiado por bioensaio,foram avaliados os ensaios com punctura defolha (Pedras & Ahiahonu, 2004) e em folhadestacada (Evidente et al., 2008).Ensaio de inibição de germinação: a fito-toxicidade de filtrados de cultura fúngica contrasem*ntes sadias de E. heterophylla foi avaliadasegundo metodologia proposta por Macias et al.(2000). Para isso, 25 sem*ntes foram transfe-ridas para placas de Petri (∅ 90 mm) contendopapel de germinação (Germitest®) embebidoem 5 mL de filtrado de cultura com Tween 80a 0,05% (m/v). Filtrados de meios de culturasem crescimento fúngico contendo Tween 80a 0,05% (m/v) e água destilada foram uti-lizados como testemunhas. As placas forammantidas em câmara climática a 25 oC efotoperíodo de 12h. Após 72 horas, determina-ram-se o número de sem*ntes germinadas eo comprimento das radículas. O delineamentoexperimental foi o inteiramente casualizado,VAREJÃO, E.V.V. et al.Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20134com quatro repetições. Os dados foram subme-tidos a análise de variância (ANOVA, p<0,05),e as médias, comparadas pelo teste de Tukey.Ensaio em câmara úmida: filtrados decultura contendo Tween 80 a 0,05% (m/v)foram uniformemente aspergidos sobre folhassadias de plantas jovens (duas a três semanas)de E. heterophylla cultivadas em casa devegetação. Filtrados de meios de cultura semcrescimento fúngico contendo Tween 80 a0,05% (m/v) e solução aquosa de Tween 80 a0,05% (m/v) foram utilizados como controle.Após aspersão das soluções, as plantas forammantidas em câmara úmida a 25 oC, e odesenvolvimento dos sintomas foi monitorado,diariamente, por 72 horas. Os sintomas foramconvertidos em grau de lesão com o uso deescala arbitrária de intensidade com base eminspeção visual: (–), ausência de sintomas; (+)amarelecimento; (++), necrose < 50% da áreafoliar; (+++), necrose > 50% da área foliar; e(++++), necrose > 50% da área foliar acompa-nhada de desfolha.Ensaio com punctura de folha: soluçõesdas frações cromatográficas (1 mg mL-1) prepa-radas em MeOH a 20% (m/v) foram aplicadassobre puncturas produzidas com auxílio deagulha na superfície adaxial de folhas sadias(duas puncturas por folha) de plântulas jovens(duas a três semanas) de E. heterophylla culti-vadas em casa de vegetação. Solução metanó-lica a 20% (v/v) foi utilizada como controle. Odelineamento experimental utilizado foi ointeiramente casualizado, com três repeti-ções. As plântulas foram mantidas em câmaraúmida a 25 oC. O aparecimento de sintomasfoi monitorado a cada 12 horas, e o diâmetrodas lesões, medido após 72 horas.Ensaio em folha destacada: folhas sadiasde plântulas jovens de E. heterophyla foramdestacadas com auxílio de estilete e pinça edepositadas em placas de Petri contendo papel-filtro umedecido com água destilada (trêsfolhas por placa). Com auxílio de agulha, foramproduzidas puncturas sobre a superfície ada-xial de cada folha (duas puncturas por folha).Sobre cada lesão, foram depositados 10 μLde solução de extratos e frações a 1 mg mL-1(m/v), preparadas em MeOH a 20% (v/v). Asplacas foram vedadas e acondicionadas emcâmara climática a 25 oC, com fotoperíodo de12 horas, por 72 horas. O desenvolvimento desintomas foi observado a cada 12 h, medindo-se o diâmetro das lesões produzidas após72 horas. Solução aquosa de MeOH a 20% (v/v) foi utilizada como controle. O delineamentoexperimental utilizado foi o inteiramentecasualizado, com três repetições.RESULTADOS E DISCUSSÃOPara investigação preliminar da capaci-dade de A. euphorbiicola produzir metabólitosfitotóxicos, o fungo foi cultivado em meio deJenkins-Prior modificado e meio Caldo deVegetais, incubadosnas condições de cultivo A.A escolha dessas condições como ponto departida para as investigações fundamenta-seem observações realizadas durante estudossobre o potencial do fungo como bio-herbicidapara o manejo de E. heterophylla. Nesses estu-dos, foi observado que a máxima produção deesporos por A. euphorbiicola ocorreu após seisa nove dias de cultivo nessas mesmas condi-ções. Após o nono dia, grande quantidade deesporos iniciou a germinação. Diversos traba-lhos relatam que a produção de fitotoxinas pordiferentes espécies do gênero Alternaria ocorreprincipalmente durante a germinação deesporos (Slavov et al., 2004; Oka et al., 2005;Parada et al., 2008).Os filtrados das culturas em meio Jenkins-Prior modificado e Caldo de Vegetais inibirama germinação e o crescimento radicular desem*ntes de E. heterophylla (Tabela 1), tendoo filtrado do meio Jenkins-Prior apresentadomaior atividade. Avaliados em ensaios emcâmara úmida, os filtrados de ambos os meiosde cultura mostraram atividade fitotóxicacontra folhas de E. heterophylla (Tabela 2). Osfiltrados das testemunhas (meios de culturasem crescimento fúngico) não produziramsintomas.Uma vez comprovada a capacidade de pro-dução in vitro de fitotoxinas por A. euphorbiicola,o fungo foi cultivado nos meios Czapek-Dox,de Fries e Jenkins-Prior, e as culturas foramincubadas sob diferentes condições, conformedescrito na seção Material e Métodos. O meiode cultura Caldo de Vegetais foi desconside-rado para esse propósito devido à sua complexacomposição química, o que poderia dificultaros trabalhos de isolamento de fitotoxinas. Aatividade fitotóxica dos filtrados de culturasPlanta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20135Toxicidade de filtrados de cultura de Alternaria euphorbiicola ...obtidos foi avaliada em experimento emcâmara úmida (Tabela 2). Os filtrados dasculturas formadas em meio Czapek-Doxnão produziram sintomas nas folhas deE. heterophylla. Os filtrados das culturasformadas em meio de Fries produzidas noescuro, tanto sob cultivo estático quanto sobagitação (condições A e B), produziram amare-lecimento e necrose em folhas da planta,enquanto o filtrado da cultura crescida nestemeio sob fotoperíodo de 12 horas (condição C)não produziu sintomas observáveis até72 horas após aplicação. Da mesma forma, ofiltrado da cultura formada em meio Jenkins-Prior modificado sob fotoperíodo (condição C)não produziu sintomas. A maior atividadefitotóxica foi observada nos filtrados de culturasformadas no meio Jenkins-Prior modificado emantidas sob agitação (condição A). Entre osmeios de cultura testados, o Czapek-Dox é oque apresenta composição mais simples,enquanto o meio de Jenkins-Prior modificadoé o mais complexo e rico em nutrientes. Comoos filtrados das culturas em Czapek-Dox nãoapresentaram fitotoxicidade e os filtrados domeio de Jenkins-Prior foram os mais ativos,pode-se concluir que a produção de fitotoxinaspelo fungo está diretamente condicionada porfatores nutricionais. Ainda, os resultadospermitiram observar que o cultivo na ausênciade luz e sob agitação favorece a produção defitotoxinas por A. euphorbiicola.Vários estudos demonstraram a influênciadas condições de cultivo sobre a biossíntese invitro de compostos fitotóxicos por fungos fitopa-togênicos. Foi observada influência do meiode cultura na produção de ácido fusárico porFusarium oxysporum f. sp. lilii. Cultivado emquatro meios distintos, a 23 oC e sob agitação(100 rpm), o fungo produziu maiores quanti-dades da toxina em meio Czapek Dox (Löffler& Mouris, 1992). O cultivo estacionário ou sobagitação pode influenciar a produção detoxinas. Brzonkalik et al. (2011) demonstraramque o cultivo estático de Alternaria alternatalevou à produção de maiores quantidades dastoxinas alternariol, alternariol metil éter eácido tenuazônico, quando comparado ao culti-vo sob agitação. A investigação da influênciadas condições de cultivo sobre a produção dafitotoxina cercosporina por diferentes espéciesdo gênero Cercospora mostrou que a compo-sição do meio de cultura, a temperatura e ocultivo sob iluminação ou no escuro exerce-ram influência na produção da toxina por todasas espécies avaliadas (Jenns et al., 1989).Diante dos resultados obtidos, para fins deprodução, isolamento e identificação de toxi-nas, o fungo foi cultivado em meio de Jenkins-Prior modificado, sob a condição de cultivo A.Os filtrados de cultura obtidos foram liofilizadose ressuspensos em água destilada para volu-me final de 1 L. A suspensão foi extraída comacetato de etila, e o extrato bruto, assim obtido,submetido a ensaios com punctura de folha eem folha destacada. Esses ensaios foramconsiderados para o direcionamento dos tra-balhos de fracionamento do extrato por reque-rerem pequenas quantidades de extratos efrações, além de permitirem avaliações quan-titativas mais precisas, quando comparados àaspersão de soluções sobre folhas. QuandoTabela 1 - Efeitos de filtrados de culturas de Alternariaeuphorbiicola sobre a germinação e crescimento radicular desem*ntes de Euphorbia heterophylla. Dados em percentualde inibição em relação ao tratamento testemunha (águadestilada)Filtrado GerminaçãoCrescimentoradicularJP 100,0 a 100,0 aCV 50,0 b 82,7 bControle JP 0,0 c 0,0 cControle CV 0,0 c 0,0 cMédias seguidas de letras iguais, na coluna, não diferem pelo testede Tukey a 5% de probabilidade. CV: Caldo de Vegetais. JP: Jenkins-Prior modificado.Tabela 2 - Efeitos de filtrados de culturas de Alternariaeuphorbiicola sobre folhas de Euphorbia heterophylla emensaio em câmara úmidaCondições de cultivoFiltradoA B CCV +++ nt ntJP ++++ +++ -Cz - - -MF ++ ++ -CV: Caldo de Vegetais; JP: Jenkins-Prior modificado; Cz: Czapek-Dox; MF, meio de Fries. Sintomas convertidos em grau de lesãopor meio de escala arbitrária, com base em inspeção visual: (–)ausência de sintomas; (+) amarelecimento; (++), necrose < 50% daárea foliar; (+++), necrose > 50% da área foliar; e (++++), necrose> 50% da área foliar e desfolha. nt: não testado.VAREJÃO, E.V.V. et al.Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20136aplicado sobre puncturas produzidas na super-fície de folhas destacadas, o extrato orgânicobruto produziu halos de clorose e necrose com1,4 mm de diâmetro, em média. Os sintomasnecróticos tornaram-se visíveis após 48 horas.Quando aplicados sobre folhas na planta (en-saio com punctura de folhas), halos necróticoscom 2,8 mm de diâmetro, em média, foramobservados em menos de 24 horas após apli-cação. Dada a maior sensibilidade e rapidezno desenvolvimento de sintomas nos ensaiosem plantas vivas, o ensaio com punctura defolhas foi selecionado para guiar o fraciona-mento do extrato. A solução metanólica a 20%(v/v), utilizada como controle, não produziulesão. O extrato orgânico bruto foi submetidoa cromatografia em coluna de sílica, forne-cendo uma fração (fração 3) capaz de produzir,a 1 mg mL 1, halos cloróticos com bordas necro-sadas com 3,5 mm de diâmetro, em média(Figura 1).A análise da fração 3 por espectroscopiano infravermelho mostrou um espectro deabsorção (Figura 2) característico de ácidoscarboxílicos de cadeia longa, com bandas deabsorção em 2.923 (νas CH3), 2.853 (νs CH2),1.707 (ν C=O), 1.462 (δs CH2 e δas CH3), 1.414(combinação de ν C-O e δ OH), 1.264 (δsCH3),Figura 1 - Lesões necróticas produzidas pela aplicação desolução da fração cromatográfica 3 (1 mg mL-1) sobre folhasde Euphorbia heterophylla.Figura 2 - Espectro no infravermelho (sólido) da fraçãocromatográfica caracterizada.1.229 (ν C-O) e 738 cm-1 (ρ CH2) (Figura 1). Aanálise por CG-EM (Figura 2) resultou nacaracterização dos ácidos graxos mirístico(2,6%), palmitoleico (2,1%), palmítico (38,5%),oleico (37,5%), esteárico (3,2%), erucico (4,2%)e do álcool graxo 9-octadecen-1-ol (10,5%)(Figura 3).A atividade fitotóxica de ácidos graxosde cadeia longa temsido demonstrada emdiferentes estudos. O fracionamento de ex-trato em acetato de etila de cultura do fungoCorynespora cassiicola em meio sólido forneceufrações cromatográficas capazes de produzirinibição da síntese de ATP em cloroplastosisolados de espinafre. Análises por IV e CG-EMlevaram à caracterização dos ácidos mirístico,palmítico, palmitoleico, linoleico, esteárico,linolênico e aracnídico (Passos et al., 2010).Diversos ácidos graxos de cadeia longa –entre eles o palmítico, o esteárico, o mirísticoe o oleico – são capazes de inibir a germinaçãode sem*ntes de diferentes espécies (Lynch,1980; Marambe et al., 1993). Esses ácidosforam capazes de provocar diminuição da ati-vidade da α-amilase e redução de ATP em se-mentes de sorgo (Marambe et al., 1993).Ainda, estudos demonstraram que váriosácidos graxos de cadeia média (C8 a C14) foramcapazes de causar descoloração de folhas,murcha e morte de diferentes espécies deplantas, dentro de um a dois dias após aplicação(f*ckuda et al., 2004). O estudo demonstrouainda que os ácidos graxos, especialmente C9,C10 e C11, foram capazes de produzir danoPlanta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20137Toxicidade de filtrados de cultura de Alternaria euphorbiicola ...a membranas celulares, induzir perda de ele-trólitos e causar decréscimo da quantidade declorofila. Segundo Lederer et al. (2004), a ativi-dade fitotóxica desses ácidos graxos tambémse deve à capacidade de induzir peroxidaçãolipídica.Os estudos sobre a atividade de fil-trados de cultura de A. euphorbiicola contraE. heterophylla resultaram na caracterizaçãode uma fração cromatográfica fitotóxicaconstituída principalmente por ácidos graxos,cujas atividades fitotóxicas já foram relatadasem diferentes trabalhos. A capacidade deinibir a síntese de ATP, de provocar diminuiçãodo teor de clorofila e de induzir peroxidaçãolipídica, observada em trabalhos anteriores, éum mecanismo de ação que pode justificar oamarelecimento produzido sobre folhas deE. heterophylla pelos ácidos graxos identificadosna fração. Como o amarelecimento de folhasconstitui o primeiro sintoma observado apósa inoculação do fungo na planta hospedeira,os resultados deste trabalho sugerem aparticipação desses ácidos graxos no processode invasão de tecidos da planta pelo fungo ejustificam estudos adicionais sobre essassubstâncias, visando a sua avaliação para odesenvolvimento de herbicidas naturais paraE. heterophylla.AGRADECIMENTOSAo Conselho Nacional de DesenvolvimentoCientífico e Tecnológico (CNPq), pelas bolsas depesquisa (LCAB, AJD, RWB), e à Coordenaçãode Aperfeiçoamento de Pessoal de NívelSuperior (CAPES).LITERATURA CITADABARBOSA, L. C. A. et al. Synthesis and phytotoxicactivity evaluation of new oxygenated analogues ofhelminthosporic acid. Química Nova, v. 26, n. 5,p. 655-660, 2003.BARBOSA, L. C. A. et al. Synthesis and phytogrowthproperties of oxabicyclic analogues related tohelminthosporin. Molecules, v. 14, n. 1, p. 160-173, 2009.BARRETO, R. W.; EVANS, H. Fungal pathogens ofEuphorbia heterophylla and E. hirta in Brazil and theirpotential as weed biocontrol agents. Mycopathologia, v. 141,n. 1, p. 31-26, 1998.BEADLE, G. W.; TATUM, E. L. Genetic control ofbiochemical reactions in Neurospora. Proc. Nat. Acad. Sci.USA, v. 27, n. 11, p. 499-506, 1941.BERESTETSKYI, O. A review of fungal phytotoxins: frombasic studies to practical use. Appl. Biochem. Microbiol.,v. 44, n. 5, p. 453-465, 2008.Figura 3 - Cromatograma de íons totais da fração 3. C14:0 (ácido mirístico); C16:1 (ácido palmitoleico); C16:0 (ácido palmítico);C18:1 (ácido oleico); (OH)C18:1 (9-octadecen-1-ol); C18:0 (ácido esteárico); e C22:1 (ácido erucico).VAREJÃO, E.V.V. et al.Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20138BRZONKALIK, K. et al. The influence of different nitrogenand carbon sources on mycotoxin production in Alternariaalternata. Inter. J. Food Microbiol., v. 147, n. 2, p. 120-126,2011.CARVALHO, L. B. et al. Interferência de Euphorbiaheterophylla no crescimento e acúmulo de macronutrientes dasoja. Planta Daninha, v. 28, n. 1, p. 33-39, 2010.CERDEIRA, A. L. et al. Agricultural impacts of glyphosate-resistant soybean cultivation in South America. J. Agric.Food Chem., v. 59, n. 11, p. 5799-5807, 2011.CHAVES, F. C. et al. New helminthosporal analogues withplant-growth regulatory properties synthesized via oxallylcation. Z. Naturforsch B, v. 61, n. 10, p. 1287-1294, 2006.CHEN, W-Q.; SWART, W. J. The in vitro phytotoxicity ofculture filtrates of Fusarium oxysporum to five genotypes ofAmaranthus hybridus. Euphytica, v. 127, n. 1, p. 61-67,2002.CURY, J. P. et al. Produção e partição de matéria seca decultivares de feijão em competição com plantas daninhas.Planta Daninha, v. 29, n. 1, p. 149-158, 2011.DEMUNER, A. J. et al. Phytotoxic constituents fromNimbya alternantherae. Biochem. Syst. Ecol., v. 34, n. 11,p. 790-795, 2006.DUKE, S. O. et al. Chemicals from nature for weedmanagement. Weed Sci., v. 50, n. 2, p. 138-151, 2002.EVIDENTE, A. et al. Phyllostictines A - D,Oxazatricycloalkenones produced by Phyllosticta cirsii, apotential mycoherbicide for Cirsium arvense biocontrol.Tetrahedron, v. 64, n. 8, p. 1612-1619, 2008.FARGUES, J. Effect of liquid culture media on morfology,growth, propagule production, and pathogenic activity of theHyphomycete, Metarhizium flavoviride. Mycopathologia,v. 15, n. 3, p. 127-138, 2001.f*ckUDA, M. et al. Phytotoxic activity of middle-chainfatty acids I: effects on cell constituents. Pest. Biochem.Physiol., v. 80, n. 3, p. 143-150, 2004.GAZZIERO, D. L. P. et al. Resistência de amendoim-bravoaos herbicidas inibidores da enzima ALS. Planta Daninha,v. 16, n. 2, p. 117-125, 1998.HOAGLAND, R. E. Microbial allelochemicals and pathogensas bioherbicidal agents. Weed Technol., v. 15, n. 4, p. 835-857, 2001.JENNS, A. E. et al. Regulation of cercosporin accumulation inculture by medium and temperature manipulation. PhysiolBiochem., v. 79, n. 2, p. 213-219, 1989.LEDERER, B. et al. Phytotoxic activity of middle-chain fattyacids II: peroxidation and membrane effects. Pest. Biochem.Physiol., v. 80, n. 3, p. 151-156, 2004.LÖFFLER, H. J. M.; MOURIS, J. R. Fusaric acid:phytotoxicity and in vitro production by Fusariumoxysporum f.sp. lili, the causal agent of basal rot in lilies.Neth. J. Plant Pathol., v. 98, n. 2, p. 107-115, 1992.LINSTROM, P. J.; MALLARD, W. G. NIST ChemistryWebBook., Gaithersburg: National Institute of Standards andTechnology, 2005. (NIST Standard Reference DatabaseNumber 69). Disponível em: <http://webbook.nist.gov/chemistry>. Acesso em: 22 set. 2011.LYNCH, J. M. Effects of organic acids on the germination ofseeds and growth of seedlings. Plant Cell Environ., v. 3,n. 4, p. 255-259, 1980.MACÍAS, F. A. et al. Search for a standard phytotoxicbioassay for allelochemicals. Selection of standard targetspecies. J. Agric. Food Chem., v. 48, n. 6, p. 2512-2521,2000.MARAMBE, B. et al. Identification and biological activity ofgermination-inhibiting long-chain fatty acids in animal-wastecomposts. Plant Cell Physiol., v. 34, n. 4, p. 605-612, 1993.MÖBIUS, N.; HERTWECK, C. Fungal phytotoxins asmediators of virulence. Current Op. Plant Biol., v. 12, n. 4,p. 390-398, 2009.OKA, K. et al. Host-specific AB-toxin production bygerminating spores of Alternaria brassicicola is induced by ahost-derived oligosaccharide. Physiol. Molec. Plant Pathol.,v. 66, n. 1, p. 12-19, 2005.PARADA, R. Y. et al. Alternaria brassicae produces a host-specific protein toxin from germinating spores on host leaves.Biochem. Cell Biol., v. 98, n. 4, p. 258-263, 2008.PASSOS, J. L. et al. Efeitos de Corynespora cassiicola sobreLantana camara. Planta Daninha, v. 28, n. 2, p. 229-237,2010.PEDRAS, M. S. C.; AHIAHONU, P. W. K. Phytotoxinproduction and phytoalexin elicitation by thephytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum. J. Chem.Ecol., v. 30, n. 11, p.2163-2179, 2004.PEREIRA, J. M. et al. Corynespora cassiicola f. sp. lantanae:a potential biocontrol agent for Lantana camara from Brazil.Biol. Control, v. 26, n. 1, p. 21-31, 2003.RIZZARDI, M. A. et al. Interferência de populações deEuphorbia heterophylla e Ipomoea ramosissima isoladas ouem misturas sobre a cultura de soja. Planta Daninha, v. 22,n. 1, p. 29-34, 2004.Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 31, n. 1, p. 1-9, 20139Toxicidade de filtrados de cultura de Alternaria euphorbiicola ...SLAVOV, S. et al. Toxin production of Alternaria alternatatobacco pathotype. Biotechnol. Biotechnol Equip., v. 18,n. 3, p. 90-95, 2004.SOUZA FILHO, A. P. S.; DUARTE, M. L. R. Atividadealelopática do filtrado de cultura produzido por Fusariumsolani. Planta Daninha, v. 25, n. 1, p. 227-230, 2007.STRANGE, R. N. Phytotoxins produced by microbial plantpathogens. Nat. Prod. Rep., v. 24, n. 1, p. 127-144, 2007.TREZZI, M.M et al. Multiple resistance of acetolactatesynthase and protoporphyrinogen oxidase inhibitors inEuphorbia heterophylla biotypes. J. Environ. Sci. Health,v. 40, n. 1, p. 101-109, 2005.VIDAL, R. A. et al. Glyphosate resistant biotypes of wildpoinsettia (Euphorbia heterophylla (L.)) and its risk analysison glyphosate-tolerant soybeans. J. Food Agric. Environ.,v. 5, n. 2, p. 265-269, 2007.